MOHSEN AZAD

مرحله اول: واسرشت سازی (Denaturation)، 30 تا 60 ثانیه

عمل انجام شده در این مرحله: جدا شدن دو رشته DNA

مرحله دوم: اتصال (Annealing)، 30 تا 60 ثانیه

عمل انجام شده در این مرحله: اتصال پرایمرها به نواحی مکمل روی DNA و تعیین محدوده تکثیر قطعه DNA

مرحله سوم: گسترش (Extension یا Elongation)، به ازای هر 1000 نوکلئوتید طول قطعه 60 ثانیه

عمل انجام شده در این مرحله: تکثیر قطعه DNA مورد نظر

این 3 مرحله بین 25 تا 40 بار تکرار می شود که به آن چرخه های PCR می گویند.

اجزا واکنش PCR
در یک واکنش PCR از نمونه DNA، آنزیم Taq polymerase، پرایمرها، بافر، یون منیزیم، نوکلئوتیدها و آب حضور استفاده می شود. توضیحات مربوط به هر یک از این اجزا در ادامه ارائه شده است:

- نمونه DNA (الگو)
تکثیر از روی نمونه DNA انجام می شود. این نمونه می تواند، قطعه ای DNA، محصول استخراج DNA ژنومی، DNA پلاسمیدی یا حتی محصول PCR دیگری باشد. معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل و EDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد. همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد.

- آنزیم Taq polymerase
این آنزیم برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف ترین آنزیم مورد استفاده در PCR می باشد. به طور معمول حدود یک واحد از این آنزیم در 50 میکرو لیتر از واکنش PCR استفاده می شود. اگر نمونه DNA حاوی مواد ممانعت کننده PCR باشد، می توان این مقدار را دو تا سه برابر افزایش داد ولی مقادیر بالاتر آنزیم باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می گردد. گرچه دمای مناسب برای این آنزیم 72 درجه سلسیوس می باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر به تکثیر می باشد برای جلوگیری از اتصال قطعات پرایمر به نقاط دیگری روی توالی نمونه DNA و امکان تولید قطعات غیر اختصاصی، توصیه می شود که تمامی مراحل آماده سازی واکنش PCR بر روی یخ صورت گیرد.

- نوکلئوتید ها
چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعه DNA از اجزا واکنش PCR می باشند که به عنوان واحد های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه DNA استفاده می شوند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر 200 نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، 10 میلی مولار و 25 میلی مولار موجود است، استفاده می شود. به طور مثال، در یک واکنش 50 میکرو لیتری PCR باید 5 میکرو لیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.

- بافر
مهمترین نقش بافر PCR تنظیم pH مناسب واکنش PCR و آنزیم Taq polymerase می باشد. اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA الگو (نمونه) کمک می کند.

- یون منیزیم
یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد. انواع مختلف آنزیم DNA polymerase برای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. برای تکثیر با Taq polymerase این یون عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم در واکنش PCR استفاده می شود. این ترکیب گاهی در همان بافر PCR قرار داده می شود ولی از آنجا که برای برخی واکنش های PCR لازم است که غلظت این یون تغییر نماید، این ترکیب به طور جداگانه تهیه و به واکنش PCR افزوده می شود.

غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی مولار است. غلظت بالاتر از این مقدار باعث تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر (قطعات غیر اختصاصی) شده و غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود.

- پرایمرها
غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغییر است. غلظت بیش از این، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود. طراحی پرایمر نیازمند دقت فراوانی است و مرحله بسیار مهمی در امکان پذیر شدن و صحت تکثیر قطعه مورد نظر دارد. دمای مرحله اتصال در برنامه PCR به توالی پرایمرها ارتباط دارد.

وسایل مورد نیاز برای واکنش PCR
حداقل وسایل مورد نیاز برای انجام واکنش PCR، دستگاه ترموسایکلر (ایجاد کننده چرخه های دمایی)، میکرو پیپت، ظرف یخ و وسایل یکبار مصرفی مانند تیپ (جز پلاستیکی که برای کشیدن محلول به میکرو پیپت متصل می شود) و ویال (لوله های درب دار کوچک، در دو اندازه بر اساس گنجایش آنها یعنی 200 و 500 میکرو لیتر، که واکنش PCR در آنها انجام می شود) و ظروف نگهداری آنها می باشد.

دستگاه ترموسایکلر برای ایجاد دماهای مختلف در مدت زمان مورد نظر، قابل برنامه ریزی می باشد. قبل از تولید این دستگاه، دانشمندان برای انجام PCR از سه حمام آب گرم با دماهای مختلف استفاده می کردند که کار بسیار پر زحمتی بود.