MOHSEN AZAD

ابزار‌هاي حجمي و سمپلر‌هاي مورد استفاده کنترل شوند

اطمينان از كاركرد صحيح دستگاهها و تجهيزات مورد استفاده بطور مثال اطمينان از صحت طول موج فيلتر‌هاي الايزا‌ريدر به كمك استفاده از ماده رنگي با ثبات، نظير بي‌كرومات پتاسيم و يا عملكرد‌صحيح دستگاه واشر (Washer)

آماده سازي بافر يا محلول شستشوي مربوط به هر كيت به اندازه مورد نياز در هر بار مصرف با دقت كامل و رعايت شرايط استيريليتي و همچنين عدم استفاده از محلول‌هاي شستشوي نامناسب يا آب مقطر ناخالص.

استفاده از نوك سمپلر‌هاي يكبار مصرف و لوله‌آزمايش عاري از هر گونه مواد شوينده و پاك كننده و براي سوبسترا از لوله شيشه‌اي كه با اسيد سولفوريك رقيق، شسته شده و با آب مقطر دو بار تقطير آبكشي شده باشد استفاده شود.

نكاتي كه در شروع انجام تست‌هاي الايزا .

بايد مورد توجه قرار گيرند .

تمامي محلولهاي موجود در كيت قبل از مصرف بايد به دماي آزمايشگاه برسد، و خوب مخلوط گردند.

قبل از مصرف، اجزاي كيت بايد از لحاظ كدورت و آلودگي قارچي و ذرات خارجي بررسي شوند سعي شود پاكت حاوي ميكروپليت‌ها به دماي اتاق رسيده، بعداً درب آن گشوده شود و سريعاً پس از جداسازي تعداد استريپ مورد نياز به داخل كيسه منتقل گردند تا از ورود گرد و غبار و رطوبت به داخل آنها جلوگيري شود.

از كليه استاندارد‌ها و كنترل‌هاي موجود كيت‌در هر نوبت كاري استفاده شود.

اجزاء كيت پس از استفاده بلافاصله به يخچال منتقل گردد زيرا منجر به افزايش پايداري كيت مي‌شود.

پس از محلول كردن سرم كنترل، 15 دقيقه (برحسب راهنماي كيت) آنرا در حرارت آزمايشگاه قرار داده سپس مورد استفاده قرار گيرد.

در پايان هر يك از مراحل، (مطابق دستور العمل كيت) عمل بهم‌زدن و مخلوط نمودن محتويات چاهكها بايد به آرامي صورت گيرد، تا از ايجاد حباب يا انتقال محلول از يك چاهك به چاهك‌هاي مجاور جلوگيري شود.

جهت كنترل كيفي و اطمينان از سالم بودن سوبسترا و كونژوگه مي‌توان حجم‌هاي مساوي از اين دو را با هم مخلوط نمود در اينصورت رنگ حاصله بايستي بسرعت ايجاد شود.

از يك تكنيك ثابت در عمل پيپت نمودن براي جلوگيري از پرتاب قطرات به ساير چاهكهاي و همچنين يكسان بودن شرايط براي تمامي چاهكها استفاده شود، براي اين منظور در هر سري كاري،آزمايش كننده خود بايد عمل پيت نمودن را انجام دهد كه اين كار بايستي بطور مايل و چسبيده به جدار فوقاني چاهكها صورت پذيرد.

اتصال محكم نوك سمپلر به بدنه سمپلر در حين كار الزامي است.

دقت در استفاده مكرر از محلول‌ها بخصوص سوبسترا و جلوگيري از برخورد نوك‌سمپلر آلوده با سوبسترا جهت ممانعت از ايجاد آلودگي قارچي يا باكتريال ضروری است.

محلول سوبستراي آماده كار بايد در هر نوبت كاري تهيه شده و از مخلوط نمودن محلول تازه با محلول قبلي جلوگيري شود.

از ايجاد خراش، برجا ماندن اثر انگشت و همچنين لبريز شدن محلول در سطوح زيرين چاهكها جلوگیری گردد.

كليه مراحل مطابق روش كيت مورد استفاده و بطور پيوسته و بدون انقطاع، بايد صورت گيرد تا از خشك شدن ميكروپليت پس از شستشو و همچنين آلودگي آنها جلوگيري شود.

از نوسانات غير تدريجي دما در هنگام انكوباسيون، مانند باز بودن پنجره يا درب آزمايشگاه در محل آزمايش جلوگیری نمائیم.

دقت در مراحل مختلف شستشو و عدم باقيماندن ذرات كونژوگه آنزيمي در كف چاهكها

توجه داشته باشید ، در صورت كريستاله شدن محلول شستشو، بايد قبل از مصرف آنرا در دماي 37 حل نمود.

جلوگيري از تبخير چاهك در مدت زمان انكوباسيون با استفاده از پارافيلم يا چسب‌هاي مناسب و يا استفاده از محفظه مسدود حاوي پنبه آغشته به آب مقطر ضروري است.

هيچگاه از محلو‌ل‌هايي كه با سري ساخت متفاوت و يا داراي اجزاي تاريخ گذشته هستند، استفاده نشود.

بايد توجه داشته ‌باشيم كه ايجاد پديده هوك (Hook Effect) باعث ايجاد نتايج پائين كاذب مي‌شود لذا توصيه مي‌شود براي جلوگيري از اين پديده سرم رقيق نشده و سرم یک دهم رقیق شده، مخلوط وآزمایش را انجام دهيم، تا اثر احتمالي هوك اصلاح شود.

دقت در رعايت دقيق T.T (Time & Tempreture)، زيرا كوتاه نمودن زمان در برخي كيت‌ها موجب كاهش يا افزايش نتايج خواهد شد.

Edge-Effect يا اثر حاشيه‌اي انكوباتور 37 درجه ‌سانتي‌گراد بواسطه شوك حرارتي و اختلاف حرارت محيط كار و محيط داخلي انكوباتور حاصل مي‌گردد و عمدتاً در سطح استريپ‌هايي كه مجاور درب خارجي انكوباتور قرار دارند ايجاد مي‌گردد، و جذب نوری(OD) غير يكنواخت خصوصاً در استريپ‌هاي ابتدايي حاصل مي‌شود. اين امر بواسطه ورود ناگهاني سرماي محيط به داخل انكوباتور مي‌باشد، لذا از انكوباسيون پليت‌هاي الايزا در مكانهايي كه شرايط محيطي متغير دارند پرهيز نمائيد.

يكي از مراحل مهم انجام تست‌هاي الايزا شستشو مي باشد نكات مهم اين مرحله شامل: :

هدف اصلي از شستشو، دفع و تخليه كامل اتصالها و مولكولهاي غير اختصاصي از محيط واكنش مي‌باشد لذا رعايت دقيق تعداد دفعات و نحوه شستشو مهم است.

فشار بالاي شستشو در روش دستي‌ناشي از تخليه سريع بافر مي‌باشد كه منجر به جدا‌سازي و حذف اتصالات اختصاصي از كف چاهكها و كاهش كاذب (OD) مي‌گردد.

فشار پائين‌شستشو بعلت تخليه آهسته بافر در روشهاي دستي منجر به عدم دفع كامل اتصالات غير اختصاصي و افزايش كاذب جذب نوري (OD) مي‌گردد.

در نظر گرفتن زمان خيس خوردن (Soaking Time) چاهك، در فواصل شستشو(مكش و تخليه) الزامي است، و معمولاً بين 40-20 ثانيه مي‌باشد، اين مرحله به جداسازي و دفع كامل اتصالات غير اختصاصي كمك مي‌نمايد.

براي شستشو بروش دستي(با سمپلر) جهت جلوگيري از آسيب فيزيكي به چاهك الايزا و جداسازي كمپلكس‌هاي پوشيده شده در كف چاهك سعي كنيد تخليه نمونه بطور مايل صورت گيرد.

در پروسه شستشو بهتر است تا نزديك لبه فوقاني چاهك از محلول شستشو پر شود، پر كردن لبالب محلول شستشو در چاهكها احتمال آلودگي چاهك به چاهك را افزايش مي‌دهد. (حجم 300μl حجم مناسبي است)

نكته مهم در شستشوي دستي و با سمپلر، جلوگيري از ايجاد حباب هوا در چاهكها و جلوگيري از سرريز شدن محلول شستشو و نیز تماس با كف چاهك‌مي‌باشد كه نهايتاً منجر به كاهش كاذب OD مي‌گردد.

محلول شستشو PBS(بافر فسفات سالين) يكي از مناسب‌ترين محلول‌هاي ايزوتونيك شستشو دهنده مي‌باشد كه كمترين اثرات تخريبي روي كمپلكس Ab-Ag در سيستم‌هاي الايزا را دارد.

در شستشو به روش دستي در مرحله مكش، چاهك‌ها بايستي بطور كامل تخليه شوند، و هيچ قطره اضافي از مايع بافر در كف چاهكها باقي نماند كه اين كار با برگرداندن يكباره ميكروپليت روي كاغذ جاذب و بدون پرز انجام مي‌گردد، خشك نمودن بيش از حد و طولاني مجاز نمي‌باشد.

توصيه مي‌شود جهت شستشوي سريعتر و راحت‌تر و دسترسي به نتايج دقيق‌تر از واشر الايزا استفاده شود.

توقف واكنش و قرائت جذب نوري با ميكرو پليت ريدر :

توقف كامل واكنش آنزيمي و جلوگيري از افزايش رنگ محيط آنزيمي پس از افزودن محلول اسيدي (Stopping) بستگي به تكان دادن كافي و كامل (Shaking) ميكروپليت‌ها دارد. تكان شديد باعث آلودگي چاهك به چاهك شده و تكان آهسته يا بكارگيري روتاتور معمولي با قطر چرخش زياد و تعداد دور كم باعث عدم اختلاط خوب معرفها و منجر به ادامه و پيشرفت جزئي واكنش در طي زمان در نتيجه تغيير OD و بروز خطا مي‌گردد.

جهت رفع مشكلات فوق توصيه مي‌شود از شيكرانكوباتور الايزا استفاده گردد.

خوانش ميزان جذب محتوي چاهكها توسط الايزا ريدر الزاماً بايستي در زمان تعيين شده انجام شود.