MOHSEN AZAD

کلیات تولید سلول های بنیادی جنینی

تولید سلول های بنیادی جنینی از موش یا انسان فرآیندی چند مرحله ای است که به طور شاخص شامل مراحل ذیل می باشد

1)توده سلولی داخلی بلاستوسیست پیش از لانه گزینی از تروفواکتودرم (لایه سلولی بیرونی )اطراف ان جدا می شود. به طور کلی جداسازی بلاستوسیست به دو روش ذیل صورت می گیرد. هر دو روش در تولید سلول های بنیادی جنینی انسانی و موشی کاربرد دارد

الف)مکانیکی : پس از کشت بلاستوسیست جنین به کف ظرف متصل می شود و سپس سلول های تروفواکتودرمی در سطح شروع به رشد می کنند ولی سلول های بنیادی جنینی که از توده سلولی ذاخلی (ICM)به سمت بالا تکثیر می یابند و بعد از چند روز (5-3)برامدگی گنبدی شکلی درست می شود در این هنگام با کمک یک پیپت می توان به راحتی ICMرا از تروفواکتودرم جدا کرد. البته گاهی نیزICM همراه با تعدادی از سلول های تروفواکتودرم جدا می شود.

ب) جراحی با کمک ابزار ایمنی (immunosurgery) : در این روش از ابزار های ایمنی یعنی کامپلیمان Complement و آنتی بادی استفاده می شود. به این ترتیب که در ابتدا آنتی بادی خرگوشی علیه سلول های موشی به محیط کشت حاوی بلاستوسیست افزوده می شود و پس از اتصال آنتی بادی ها به سلول های تروفواکتودرمی که در سطح قرار دارند بلاستوسیست ها به محیط حاوی کامپلیمان خوکچه هندی منتقل می شوند. در این زمان کامپلیمان در کنار آنتی بادی فعال می شود و سلول های تروفواکتودرمی را لیز میکنند. لازم به ذکر است از انجا که ICMدر داخل قرار دارد و و هیچ گونه آنتی بادی به ان متصل نمی شود بنابراین به طور سالم باقی می ماند.

2) کشت ICM برسلول های تغذیه کننده : کشت سلول های تغذیه کننده برای رشد سلول های بنیادی جنینی به منظور تامین مواد ناشناخته مورد نیاز سلول های بنیادی جنینی است البته گاهی سلول های بنیادی جنینی را بدون سلول های تغذیه کننده کشت می دهند ولی در این هنگام کشت سلول های بنیادی جنینی نمی تواند برای مدت طولانی باشد زیرا احتمال تمایز خود به خود انها حتی در حضورLIF (Leukemia Inhibitory Factor) به عنوان عامل ممانعت کننده تمایز زیاد است.در تمامی موارد تقسیم سلول های تغذیه کننده را قبل از هم کشتی با سلول های بنیادی جنینی متوقف می کنند. ممانعت از تقسیم سلول های تغذیه کننده به دو روش تابش اشعه گاما و یا استفاده از مایتومایسین C انجام می شود. مایتومایسینC بین دو رشته DNAقرارمی گیرد و از جدا شدن انها برای تقسیم ممانعت می کند. سلول های رایج تغذیه کننده فیبروبلاست های جنینی موش هستند. البته ازدودمان STO که یک رده نامیرا از فیبروبلاست موشی هستند نیز استفاده می شوند. سلول های دیگر مانند سلول های کارسینومای مثانه انسانی 5637 و یا رده نا میرای تخمدان هامستر چینی (CHO) نیز گاهی در مراحل اولیه تولید سلول های بنیادی جنینی بکار می روند.

3) با تکثیر ICM بر سلول های تغذیه کننده و پاساژ انها بعد ازگذشت چند روز بر روی سلول های تغذیه کننده کلونی یا کلونی هایی ظاهر می شود. در این هنگام باید انها را از کف ظرف همراه با سلول های تغذیه کننده جدا کرد و پس از تفکیک سلول ها از یکدیگردوباره ان را کشت داد.

4)حصول سلول های بنیادی جنینی : با پاساز کلونی ها به صورت تک سلولی بر سلول های تغذیه کننده جدید بعد از دو یا سه روز کلونی های بزرگتری تشکیل می شود. از این به بعد هر دو یا سه روز یک بار انها را پاساژ داد. نکته جالب آن است که می توان آنها را به مدت طولانی کشت داد یا برای سالها منجمد نگاه داشت و در شرایط مطلوب حالت غیر تمایزی و کاریوتیپ طبیعی خود را برای سالها حفظ می کنند.

حفظ سلول های بنیادی جنینی در حالت نامتمایز :

همان طور که گفته شد یک سلول بنیادی واقعی قابلیت حفظ نوسازی خود یا به عبارتی توانایی ایستایی در حالت غیر تمایزی را به طور نامحدود دارد. حالت غیر تمایزی سلول های بنیادی جنینی با نشانگرهای سلولی خاص نشان داده می شود این نشانگرها به دانشمندان کمک می کند تا درک بهتری از تکثیر نامحدود سلول های بنیادی جنینی در شرایط مطلوب کشت داده شده باشند. تا کنون دو مسیر اصلی تحقیق شواهدی را نشان داده که یک مسیر شامل کوشش های است که تکثیر فاکتورهای ترشحی نظیر فاکتورهای ترشحی نظیر فاکتور ممانعت کننده لوکمیایی(LIF) بر سلول های بنیادی جنینی موش در محیط آزمایشگاهی را بررسی می کند و مسیر دوم تحقیق فاکتورهای نسخه برداری نظیر Oct-4 را در بر می گیرد.

فاکتور ممانعت کننده لوکومیایی (LIF)سایتوکاین منعلق به خانواده IL-6 است که برای اولین بار با تاثیر بر القای تمایز سلول های لوکومیایی MI شناخته شد. اما در سال 1988اثر ممانعت کنندگی آن بر سلول های بنیادی جنینی موشی شناخته شد. افزودن LIF بر تولید و حفظ سلول های بنیادی جنینی در حضور سرم جنینی گاوی بدون نیاز به سلول های تغذیه کننده کافی است. این موضوع نشان می دهد که این فاکتور یک فاکتور خارجی منحصر به فرد برای نوسازی دایم سلول های بنیادی جنینی است. عملکرد LIF تنها برای جلوگیری از تمایز سلول های بنیادی جنینی است و عمل تکثیر سلول های بنیادی جنینی است مستقل ازLIF است. جالب ان است که LIF در سلول های لوکمیایی القا کننده تمایز است ولی بر سلول های بنیادی جنینی موش اثر ممانعت کنندگی از تمایز دارد. به همین دلیل به آن فاکتور ممانعت کننده تمایز (DIF) نیز می گویند. این فاکتور از طریق گیرنده خود به نام stat 3 عمل می کند.

Oct-4 پروتئینی که توسط سلول های بنیادی جنینی انسانی و موشی در محیط آزمایشگاهی بیان می شود. این فاکتور توسط سلول های ICM موشی درin vivo نیز بیان می گردد. Oct-4 در سلول تخم موش وجود دارد و درسراسر بلاستوسیست تا ظهور ICMوحفظ پرتوانی ICM و اپی بلاست وجود دارد. همچنین Oct-4 در سلول های زاینده موش و سلول های زاینده بالغ وجود دارد. سلول های بنیادی جنینی موشی می توانند به طور نامحدود در محیط آزمایشگاهی همانندسازی کنند و10-1 میلیارد را بدون تمایز به وجود آورند. در محیط آزمایشگاهی سلول های بنیادی جنینی موشی و انسانی Oct-4 را بیان می کنند.

برای حفظ پرتوانی سلول های بنیادی جنینی بیان Oct-4 لازم است. به طوری که اگر از بیان Oct-4جلوگیری نماییم. سلول های نیادی جنینی به تروفواکتودرم تمایز می یابد. اگر بیانOct-4 را به طور مصنوعی زیاد کنیم سلول های بنیادی جنینی موش به اندودرم و مزودرم ابتدایی تمایز می یابند. بنابراین مقدار بیان Oct-4 وضعیت برنامه تکوینی سلول های بنیادی جنینی موش را نشان می دهد. و ان را به عنوان کاندیدای تنظیم کننده اصلی پر توانی سول های نیادی جنینی معرفی می کند.

این که چگونه و چرا فاکتور نسخه برداری Oct-4 چنین نقش مهمی را در جنین زایی ایفا می کند به ژن های تحت کنترل ان بستگی دارد. تا کنون مشخص شده 7تا 8 ژن تحت کنترل Oct-4 هستند. به طوری که Oct-4 بعضی از انها را فعال کرده ویا از فعالیت بعضی دیگر ممانعت می کند. در کل ممکن است Oct-4 سبب ممانعت از عمل ژن هایی شود که برای تمایز لازم هستند.

تا کنون معتقد بودند که موضوع پرتوانی سلول های بنیادی جنینی به چهار بازیگر مهم یعنی Stat3,Sox2,OCT-4,FoxD3 برمیگردد. اما اجرای کنسرت مزبور با هیچکدام از عوامل ذکر شده به تنهایی شروع نمی شود چرا که ضاهرا به بازیگران دیگری نیاز است. Oct-4 برای تنظیم سرنوشت سلولی در جنین ابتدایی و در توده سلولی داخلی بیان می شود و بیان ان در تروفوبلاست کاهش می یابد. Sox2وFoxD3 دیرتر در جنین بیان می شوند و در حفظ اپی بلاست بعد از لانه گزینی ضروری هستند. در سلول های بنیادی جنینی،Stat3 با سیتوکین LIF فعال می شود و این فرایند برای حفظ نوزایی انها ضروری است. اما برای تکوین طبیعی موش به LIF نیازی نیست. تا به امروز دو فاکتور رونویسی Stat3 وOct-4 شناخته شده اند که در نوزایی سلول های بنیادی جنینی شرکت دارند. اما اخیرا یک فاکتور رونویسی همئوباکس شناخته شده که در سلول های داخلی مورولا و بلاستوسیست سلول های بنیادی جنینی و سلول های زاینده جنینی مشتق از انها بیان می شود. نام این فاکتور Nanog است که به معنی سرزمین همیشه جوان می باشد. این فاکتور در دومین رخداد تخصصی شدن (specification) سلول های جنینی نقش حیاتی دارد. Oct-4در این مرحله و قبل از ان ایفا نقش می کند. فنوتیپ جنین های فاقد Oct-4 وNanog نشان داده است که هویت سلول های بنیادی جنینی به فعال نگه داشتن سیستم تنظیم کننده سلول بنیادی و خاموش کردن سیستم تمایز بستگی دارد.

شناسایی Nanog دیدگاه جدیدی را در کشت سلول های بنیادی جنینی مطرح کرد به طور که تا کنون معتقد بودند که حفظ نوزایی سلول های بنیادی جنینی به همکاری Stat3 فعال شده (از طریق LIF ) و تجلی Oct-4 نیازدارد. اما نشان داده شده است که بیان زیادی Nanog (overexpression) خود نوزایی سلول های بنیادی جنینی را از وابستگی به تحریک LIF/Stat3 خلاص می کند. به عبارتی در این شرایط باز هم سلول ها به نوزایی خود ادامه می دهند. علاوه بر این با بیان زیادی Nanog قابلیت تمایز سلول های بنیادی جنینی کاهش می یابد و به تاخیر می افتد. اما حذف بیان زیادی Nanog سبب برگشت سلول ها به حالت بنیادی اولیه می شود. از سوی دیگر حذف Nanog سبب اغاز تمایز سلول های بنیادی جنینی به اندودرم احشایی می گردد واین نشان دهنده نقش ان در دومین رخداد تمایز جنینی است. این نتیجه همراه با این مشاهده که LIF وNanog اثر افزاینده بر خودنوزایی سلول های بنیادی جنینی دارند پیشنهاد می کند که این دو عامل دو خزانه هدف ژنی متفاوت را کنترل می کنند که تا اندازه ای بر هم پوشانی دارند.

کمبرز و همکاران گزارش کردند کهNanog در سلسله مراتب رونویسی مداخله کننده در هویت سلول های بنیادی و حفظ پر توانی انها شرکت دارد. به طوری که بیان زیادی Nanog بر خودنوزایی سلول های بنیادی از طریق فعال کردن Stat3 عمل نمی کند و بر عکس ان فعال کردن Stat3 بر بیان Nanog اثر ندارد. علاوه بر این Nanog و Oct-4 به صورت کنسرت در حفظ پرتوانی و نوزایی سلول های بنیادی جنینی عمل می کنند. به طوری که ایشان مشاهده نمودند اولا: Nanogدر جنین هایی که از نظر Oct-4 معیوب هستند بیان می شود ثانیا: بیان زیادی Nanog نمی تواند برنامه تمایزی سلول های بنیادی جنینی را که با کاهش (downregulation) Oct-4 شروع شده است را برگرداند. بنابراین Nanog,Stat3 و Oct-4 با سه مسیر رونویسی متفاوت در سلول های بنیادی جنینی عمل می کند.

به نظر می رسد چرخه سلولی بنیادی جنینی در ممانعت از تمایز ان دخیل است. از مطالعه انواع مسیرهای پیام رسانی مشخص می شود که فاکتورهای بسیاری باید در تعادل با هم باشند تا سلول های بنیادی جنینی در حالت نوسازی باقی بمانند. اگر در این حالت تغییری به وجود اید سلول های بنیادی جنینی تمایز می یابند.